背景介绍

氮是植物生长发育的常量营养元素。作为一种重要的常量营养素，氮是植物中核酸、蛋白质、辅助因子和植物激素的重要组成部分。氮的作用已通过其对叶片扩张和开花的影响得到清楚的例证，氮营养对根系生长发育有影响。

氮的吸收、运输、同化和再动员等过程非常复杂，已经鉴定出许多氮响应基因，在水稻低氮胁迫早期发现了10,422个基因，以往关于氮调控基因的报道主要集中在转录因子(TF)和miRNA。在过去几年中，越来越多的TF，如MADS-box、LBD和NLP，已被报道为调节植物硝酸盐反应的核心成分。

毛竹是最具代表性的竹种之一，森林面积468万公顷，占中国竹林总面积的72.96%。毛竹具有生长快、再生能力强、机械强度优良等特点，一直是很有前途的木材替代品。

非编码RNA参与枝条生长、木质化和干旱胁迫反应，氮是影响毛竹快速生长的无机养分，毛竹中氮代谢的酶活性和分子机制备受关注，AMTs、NPF s和NLP s参与氮代谢。

此外，已有报道称circRNAs可能参与毛竹的枝条生长和干旱胁迫，并且也报道了circRNA对植物氮素的响应。然而，大多数研究都集中在竹子的功能基因上，不同氮浓度处理下竹根中circRNAs的功能尚不清楚。

在这项研究中，使用高通量测序来鉴定和预测暴露于三种浓度氮[0mMKNO 3 (N0)、6mMKNO 3 (N6，对照)和18mMKNO 3 (N18)][ 36 ]。我们鉴定了差异表达的circRNAs(DECs)并注释了这些DECs的宿主蛋白编码基因。

构建了circRNA-miRNA-mRNA的核心调控模块，并通过实时定量PCR(qPCR)和荧光素酶报告基因检测进一步验证。毛竹响应氮胁迫的ceRNA调控机制提供了新的见解。

氮胁迫下毛竹中circRNA的表征

为了鉴定毛竹中的N反应性circRNA，我们从之前的研究中收集了九组测序数据。从9个样本中生成了总共482,510,256个干净的读数。在去除接头和低质量序列以及引物序列后，原始读数被映射到毛竹基因组。

鸟嘌呤和胞嘧啶(GC)含量约为53.72%，Q30大于93.99%，使用CIRI工具从样本中检测到总共549个circRNA。此外，在所有三个比较中都发现了95个circRNA。根据基因组位点，大多数毛竹circRNA由外显子组成b). circRNA的长度变化范围很广；主要的外显子circRNA长度在200bp和1,000bp之间，主要的基因间circRNA>3,000bp，表明每个circRNA可能有不止一个miRNA结合位点和多个RNA结合蛋白。

计算每条染色体上的circRNA数量。例如，13、14、15号染色体上circRNA的丰度和分布远大于其他染色体。

此外，272个宿主基因共衍生出309个circRNA，其中80.26%只产生了一个circRNA，其余产生了不止一个circRNA，最多的是一个宿主基因产生的9个circRNAe)。同一个宿主基因通过可变剪接产生不同的circRNA，这些可变circRNA以三种方式之一相互关联：无关联，或一个包含另一个，或一个具有相似的剪接位点而另一个具有不同的剪接位点。

为了确认毛竹中存在的circRNA的真实性，随机选择了三个高表达的circRNA进行实验验证，使用会聚和发散引物进行聚合酶链反应（PCR）和Sanger测序。由于circRNA的结构不同于线性RNA，因此使用第一链互补DNA（cDNA）和基因组DNA（gDNA）样本进行扩增。

来自三个circRNA的会聚引物在cDNA和gDNA样本中产生了一条不同的条带，并且仅在cDNA样本中检测到三种circRNA的不同引物的PCR产物，表明存在反向剪接连接但不存在基因组重排。

此外，通过Sanger测序进一步检测不同引物的PCR产物，以确认反向剪接点，这些基因的qPCR结果显示表达模式与RNA-seq结果一致。

氮胁迫下毛竹差异表达circRNAs(DECs)分析

circRNA的表达特异性提供了对其生物学功能的深入了解。为了揭示不同氮浓度下毛竹中circRNA的表达模式，在三个基因排组中，鉴定出的549个circRNA被过滤，仅保留在至少两个生物学重复中检测到的那些。

过滤后的circRNA用于后续的差异表达分析，根据筛选标准，在三个比较中分别确定了24、33和15个DEC（N0与N6；N0与N18和N6与N18）。最终共获得52个DECs，同时也展示了各组DECs的表达情况b). 在N0和N6中，14个DEC被上调，10个DEC下调，在N0和N18中，21个DEC上调，12个DEC下调。

显然，N6与N18中的DEC数量最少，这可能意味着N6和N18处理之间的circRNA差异很小。上述确定的DEC可能在氮胁迫下对毛竹具有特定功能。

毛竹circRNA宿主基因的功能预测

尽管一些circRNA已被证明参与其宿主基因表达的调控，但大多数circRNA的分子功能尚不清楚。根据circRNA与基因组位置的比对，获得了52个DECs的宿主基因。总共预测和注释了20个宿主基因，而其余32个宿主基因没有亲本编码基因。

为了进一步研究DECs参与毛竹氮素吸收和利用的潜在功能，对这20个预测的宿主基因进行了功能富集分析。

基因本体论（GO）富集分析表明，这些宿主基因被分配到29个GOterm，其中16个、10个和3个GOterm分别被分类为生物过程、细胞成分和分子功能A）。在生物过程中，“细胞过程（GO：0,008,152）”和“代谢过程（GO：0,009,987）”是最具代表性的GO术语，其次是“单一生物过程（GO：0,044,699）”类别。

最重要的是，许多细胞成分被发现与“细胞(GO:0,005,623)”、“细胞部分(GO:0,044,464)”和“细胞器(GO:0,043,226)”密切相关。在分子功能组中，两个主要的典型类别是“结合（GO：0,005,488）”和“催化活性（GO：0,003,824）”。还进行了京都基因和基因组百科全书(KEGG)通路分析，以进一步探索DEC宿主基因的功能。

circRNAs的宿主基因在三个途径中显着富集，包括“磷脂酰肌醇信号系统（ko04070）”，“淀粉和蔗糖代谢（ko00500）”， 4 b). 该结果暗示毛竹中circRNAs的宿主基因可能参与物质合成和能量代谢过程以及信号转导。

KOG和COG注释表明四种mRNA可能与氨基酸转运和代谢有关，例如丝氨酸羧肽酶和芳香族氨基酸脱羧酶，四个靶基因被注释为与碳水化合物转运和代谢相关。

此外，转录因子和蛋白激酶也由Pram数据库注释。因此，与氮反应相关的circRNA可能通过使用ceRNA调控网络来调节一些与碳和氮代谢相关的mRNA，从而在氮同化中发挥重要作用。

氮是最重要的必需常量营养素，在植物萌发、生长、发育和繁殖中起着初步作用。毛竹中的氮素运输、利用和同化已得到广泛研究。然而，circRNAs在毛竹氮素响应过程中的作用尚未见报道。

结果表明，小麦中的氮处理改变了circRNA的表达谱。在这项研究中，52个circRNA被鉴定为氮处理幼苗之间的DECA）。有趣的是，我们发现一些circRNA，如PeSca_16:4,086,858|4,148,319、PeSca_16:12,085,139|120,809,954和PeSca_24:10,801,870|10,821,990，在N6和N18组特异性表达，而PeSca_4：24,750,186|24,761,463具体表示在N0组。

毛竹中氮处理后circRNA丰度的波动可能与circRNA响应氮的可能作用有关。此外，结果表明circRNA的表达与其宿主基因的表达相关。circRNA的过表达可以降低其亲本基因的表达水平。来自SEPALLATA3的circRNA已显示通过R环形成调节宿主基因表达。

在本研究中，GO和KEGG富集分析的结果证实了DECs的宿主基因参与了多种重要的生物过程，包括细胞和代谢过程。在氮处理下的小麦幼苗根中也发现了类似的结果。因此，这些结果表明，毛竹中的circRNA可能在不同氮条件下的代谢物合成中起着至关重要的作用。

许多研究报道miRNA参与植物氮代谢。例如，在响应低氮胁迫的花生( Arachishypogaea)中鉴定出20种miRNA。一些miRNA被预测会在缺氮条件下靶向玉米中的某些circRNA。

一些研究表明miR482、miR1512和miR1515与固氮有关，进一步的研究推测这些miRNA可能靶向大豆中的circRNA[ 3 ]。在本研究中，共有18个DECs可以充当53个DEM海绵，同时发现了114个miRNA-circRNA相互作用，表明这些circRNA可能作为miRNA海绵在氮胁迫下调节毛竹的基因表达。

研究表明miR166、 miR169和miR394家族成员可能参与氮胁迫[ 18,52,53 ]。同样，在本研究中也鉴定了novel_miR192、novel_miR26、novel_miR260和novel_miR40。因此，circRNA可能通过海绵miRNA影响mRNA的表达。

结论

在实验研究中，利用小RNA数据在氮胁迫下的毛竹中构建了一个circRNA库，鉴定出549个独特的circRNA。通过比较不同氮条件下的毛竹根系，获得了52个DECs，并研究了这些DECs的表达模式。使用GO和KEGG分析根据它们的宿主基因预测了这些DEC的可能功能，表明这些circRNA可能参与毛竹的能量代谢过程和信号转导。

在18个DEC和53个DEM中发现了总共114个miRNA-circRNA相互作用对。构建了一个circRNA-miRNA-mRNA的调控网络，包含5个DECs、8个DEMs和32个DEGs。

此外，PeSca_6:12,316,320|12,372,
905-novel_miR156-PH02Gene35622的一个模块通过qPCR和荧光素酶报告基因检测得到验证。这些结果表明circRNAs可能参与了毛竹对氮素反应的调控。但这些circRNAs在毛竹中的功能和调控作用还需要进一步的实验验证。